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细胞株的筛选需要注意哪些因素

浏览次数:263发布日期:2020-02-25
   细胞株在生物制药中使用非常广泛,细胞株培养条件简单,贴壁强度适中,比较容易转染,很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物,而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质,包括生物和化学物质。
  细胞株的筛选我们要注意加药时间以及维持浓度:
  1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以细胞株筛选时不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加筛选。随着细胞的代谢,浓度和活性都会下降,所以每3-5天都要更换一次筛选液。
  2.加抗生素的时机,主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度,一般是稳定细胞株筛选浓度的1/2。
  关于维持浓度,有人说细胞会出现对抗生素的抗性,应不断提高其浓度。而且如果要挑选几个阳性克隆中较高表达的克隆的话,可以调整抗生素的浓度。当然,抗性基因高表达,目的基因不一定就跟着高表达。
  此外,也需稳定细胞系构建培养液:
  加药筛选稳定细胞株约6天左右,细胞会大量死亡,孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现:
  1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质,导致那些有表达阳性细胞死亡,即非选择性死亡,因此要及时换液。
  2.孔中细胞数目很少,细胞之间的信号会变得很弱,也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液,再转染后筛选稳转细胞株过程中就可以应用这种培养基。
  3.适当增加血清浓度。
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