养好细胞注意点（二）

（一）何时须更换培养基。培养基中是否须添加抗生素。

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

一般正常培养状态下，培养基中可以添加抗生素。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL。

(二）贴壁细胞传代时所使用的 trypsin-EDTA 浓度及相应处理

一般使用的 trypsin-EDTA 浓度为 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 的活性降低，并可减少污染的机会.。

（三）将一般动物细胞离心下来，离心速率多少

回收动物细胞，其离心速率一般为 1 000 rpm，5~10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

（四）细胞的接种密度

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。

（五）细胞冷冻培养基的成分及DMSO的等级

动物细胞冷冻保存时zui常使用的冷冻培养基是含 5~10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即为无菌状况，*次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中避光保存。

（六）冷冻保存细胞的方法及冷冻细胞浓度

将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以含有DMSO*培养基或胎牛血清的冻存液重悬细胞至终浓度约1x10⁶/ml。。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻。次日保存到液氮中。 

冷冻管内细胞数目一般为 1x10⁶ cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x10⁶ cells/ml vial 为宜。