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ATCC细胞株传代培养常见问题

浏览次数:1016发布日期:2015-10-27
   ATCC细胞株在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。ATCC细胞株一般使用蛋白水解酶(比如胰蛋白酶)消化贴壁细胞成单个细胞,也可加入乙二胺四乙酸(EDTA)提高消化能力,EDTA 是一种二价离子的螯合剂,能抑制细胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的细胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA,一般用不含Ca2+和Mg2+的盐溶液配置,先用胰酶-EDTA 消化液清洗细胞(5.0 -10.0 ml/75cm),然后弃去消化液,重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask) ,观察ATCC细胞株直到细胞变圆脱离瓶壁,此过程一般需要5-15分钟,为了避免细胞成团,消化细胞的过程中不要拍打细胞瓶。对于特别难消化的细胞,可以加入胰酶EDTA 消化液后把细胞置于37°C 促进消化,ATCC细胞株脱离瓶壁后,立刻加入含有血清的完全培养基中止消化,血清中某些蛋白质能够抑制胰酶的活性。一般情况下,离心并不需要。如果细胞需要无血清或者低血清的培养基,可以以125000g 转速离心5分钟,然后弃去中止用的培养基,加入适合的新的培养基轻轻混匀细胞,移入到新的培养瓶。传代的比例视细胞类型而定,ATCC细胞株一般是1:2-1:20,具体比例可参考说明书。胰蛋白酶会对某些细胞的细胞膜产生损伤,对于这种类型的细胞,可用细胞刮轻轻刮下细胞,加入适量的培养基,轻轻吹打混匀细胞,然后进行传代培养。
  ATCC细胞株的污染鉴定、预防和处理问题。
  普通微生物污染:培养基浑浊,高倍镜观察有微生物污染;按规定弃用并全面严格灭菌。
  支原体污染:显微镜无法观察,依经验表现为细胞生长缓慢,有细胞漂浮等等,应通过PCR 等方法鉴定,如发现支原体污染,ATCC细胞株应按规定弃用,实验室要及时全面消毒灭菌,防止蔓延。(有些常规性细胞学实验不受支原体污染影响,可以继续使用细胞传代,为防污染扩大蔓延,可以选择性的在培养基中加入价的其它种抗生素,并在隔离实验室操作和独立使用一切用具与培养基等)。
  了解每株ATCC细胞株可能产生的生物危害是很难的,但是强烈推荐,所有的人类和其他灵长类生物的细胞在能否预防HIV和肝炎病毒的实验条件下操作,所有的操作必须在垂直层流超净台内操作(推荐生物安全柜),操作过程中产生的废液和废仪器都要经过清洗、酸处理等处理后才能丢弃。
 
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