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IMR-90人胚肺成纤维细胞操作流程

浏览次数:422发布日期:2020-06-17
   操作流程:
  1、主要试剂与仪器:倒置相差显微镜。
  2、细胞的复苏培养传代及冻存:
  1)细胞的复苏培养从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液(37℃预热,8~10倍体积)离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液,以1×105/ml密度接种于25cm2培养瓶内,在37℃、5%co2及饱和湿度下培养。
  2)细胞传代原代培养的hek-293细胞48h换液1次,细胞长至60%~70%融合时,用0.25%胰酶消化1~2min,将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散,为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次,获得细胞悬液,然后加入倍量的培养基,温和混匀,吸管分装混合液,传代扩增细胞。
  3、细胞形态的观察在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。
  4、细胞的计数常规消化细胞,待细胞变圆、脱壁并浮起,加入少量培养基离心,再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液,用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数,按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液=(四方格细胞数之和/4)×104。
  5、细胞的贴壁率指数生长期的细胞,以0.25%胰酶消化成单细胞悬液,计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中,每两小时随机取出3瓶细胞,吸除培养基及未贴壁细胞,加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞,取其平均值,按照公式:贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数)×100%,计算贴壁率。
  6、生长曲线取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液,以1×104/孔接种于24孔板,每孔加入1ml培养基。每天随机取3孔,计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d,绘制细胞生长曲线
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