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传代细胞的传代方法及操作过程

发布时间:2013-04-18      点击次数:4617

传代细胞的传代方法及操作过程

实验原理
    传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:2以上的比例转移,接种到另一培养瓶的培养。
    这种培养,*步也是制备细胞悬液,当细胞长成致密单层时,它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物,做为消化液。
    细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长,必须满足两个基本要求:一是供给细胞存活所必需的条件,如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
主要试剂
L磷酸盐缓冲液(PBS)
无钙、镁溶液
细胞消化液:0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA
EMEM液
3%谷氨酰胺
0.5%台盘蓝染液等
主要设备
    解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好,9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。
    此外,还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。
实验材料
喉癌细胞
实验步骤
在做传代细胞培养之前,首先将培养瓶置于显微镜下,观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层,如已长成单层,即可进行细胞的传代培养。
1. 营养液配制:
EMEM液                                90%
犊牛血清                                10%
双抗(1万单位/m1)                加至约100单位/m1
3%谷氛酞胺                           1m1
7.4%NaHCO3                         调pH至6.8—7.0
2. 换液:
在酒精灯旁打开瓶塞,倒去瓶中的细胞营养液。
3. 消化与分装
    在上述瓶中加入1mlEDTA溶液,轻轻摇动,将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液(0.02%EDTA或0.04%EDTA1ml加0.5%胰蛋白酶液0.2ml)以盖满细胞为宜,置于室温,停留1—2min后,翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙),如出现缝隙,即可倒去消化液;如末出现缝隙,则可将瓶翻回,继续进行消化,直到出现缝隙为让。此时,可倒去消化液,加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液,反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时,可继续轻轻地吹打细胞悬液,以使细胞散开。随之进行分装。
4. 培养
    分装好的细胞瓶上,做好标志,注明细胞代号、日期。置于培养架上,轻摇使细胞均匀分布,以免堆积成团。然后置于37℃培养。
5. 观察
   1) 观察体外培养细胞的几个问题;
细胞培养24h后,即可进行观察,观察的重点如下:
      a. 首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度
      b. 观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。
      c. 如细胞已生长,则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照2)的描述进行。
      d. 观察完毕,可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。
   2) 细胞的生长阶段及其形态特征
传代培养的细胞需逐日进行观察,注意细胞有无污染,培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞,从培养开始,经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程,但为了观察及描述,人为地将具分为5个时期,但各期间无明显界限。现分别描述如下:
      a. 游离期:当细胞经消化分散成单个细胞后,由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以,此时细胞多为圆形,折光率高,此期可延续数h。
      b. 吸附期(贴壁):由于细胞的附壁持性,细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后,便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞,如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点,大多立体感强,细胞内颗粒少,透明。
      c. 繁殖期:培养l2h以后直到72h,细胞进入繁殖期,加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群,常散在地分布在瓶壁上),到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点:透明,颗粒较少,细胞间界限清楚,并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率,又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下:
十:细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25%以内有新生细胞。一般要观察3—5个视野内的细胞生长状况,然后加以综合分析判断。
十十:细胞占瓶壁有效面积的25—75%以内具新生细胞。
十十十:细胞占瓶壁有效面积的75—95%具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。
十十十十:细胞占瓶壁95%以上,细胞已长满或接近长满单层,细胞致密,透明度好。
从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。
      d. 维持期:当细胞形成良好单层后,细胞的生长与分裂都减缓,并逐渐停止生长,这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊,细胞内颗粒逐渐增多,且透明度降低,立体感较差。由于代谢产物的不断积累,维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。
      e. 衰退期:由于溶液中营养的减少和日龄的增长,以及代谢产物的累积等因素,此时细胞间可出现空隙,细胞中颗粒进一步增多,透明度更低,立体感很差。若将细胞经固定染色处理后,可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。zui后,细胞皱缩,逐渐死亡,从瓶壁上脱落下来。

 

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