菌种保藏的基本方法

　　1、梭氏法

　　将容有1滴细胞悬液的小管﹐置于盛有氢氧化钾或五氧化二磷吸水剂的大试管中﹐用真空泵抽至1、3帕时﹐将大试管密封保存。这是为减少细胞死亡率而采取的一种不经冻结﹑缓慢脱水的干燥保藏法﹐适用于多种细菌﹑真菌。

　　2、冷冻真空干燥法

　　将细胞悬液每0、1~0、2毫升注入一无菌安瓿瓶﹐于-40℃预冻1小时﹐再于-20~30℃﹑真空度为13、3帕的条件下脱水。在脱水过程后期﹐安瓿瓶外温度可逐渐升至25℃。脱水后的样品含水量应在3%以下。后﹐将安瓿瓶保持真空度1、3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。为防止细胞在冻结和脱水过程中损伤或死亡﹐要用保护剂制备细胞悬液。保护剂有脱脂牛奶﹑血清﹑10%蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通过氧和离子键对水和细胞所产生的亲合力来稳定细胞成分的构型。此法适用于病毒﹑衣原体﹑枝原体﹑细菌﹑放线菌﹑酵母菌﹑丝状真菌等的长期保存﹐是当前保藏菌种的一个重要方法。但是﹐盐杆菌﹑发光杆菌﹑黏杆菌﹑阿舒囊霉﹑多囊霉﹑担子菌中的大多数属种不适用于此法保存。

　　3、液态氮超低温冻结法

　　用甘油或二甲亚(DMSO)作保护剂制备细胞悬液﹐分装入无菌安瓿瓶﹐每管0、2毫升﹐在控制温度下降速率为1℃/分钟的条件下预冻至-40℃﹐然后立即放入液氮生物贮存罐中气相(-150℃)保存。恢复培养时﹐先直接侵入38℃水浴中解冻5~10分钟﹐再种植于适宜培养基内培养。这是根据在低于-130℃时一切生化反应处于停止状态﹑微生物也不能进行代谢活动而设计的冻结法。为避免冻死﹑冻伤和细胞内形成大量冰晶﹐用保护剂制备悬液并控制预冻时的冷却速率和解冻时融化速率。微生物的大多数属种适于慢速冻结和快速解冻。此法适用于病毒﹑枝原体﹑各种细菌﹑放线菌﹑酵母菌﹑丝状真菌﹑蓝藻等。

　　4、定期移植法

　　将菌种接种于所要求的培养基上﹐在适温度中培养﹐至静止期或产生成熟的孢子时﹐置入5℃的冰箱(或冰库)保存。在培养和保存的过程中﹐由于代谢产物的累积而改变了原菌的生活条件﹐结果菌落群体中的个体就不断衰老和死亡﹐因此每5~15天或1~4个月重新移植一次﹐具体间隔时间因种而异。凡能人工培养的微生物都可用此法保存。此法不需特殊设备﹐但烦琐﹐费时﹐而且经常移植容易引起菌种退化。

　　5、矿油封藏法

　　将化学纯的液体石蜡(矿油)经高压蒸气灭菌﹐放在40℃恒温箱中蒸发其中的水分﹐然后注入斜面培养物中﹐使液面高出斜面约1厘米。将试管直立﹐放在15~20℃室温中保存。由于在斜面培养物上覆盖一层液体﹐既能隔绝空气﹐又能防止培养基因水分蒸发而干燥﹐可以延长菌种保藏的时间。但注入的液体必须不与培养基混溶﹑对菌种无毒﹐不易被利用和挥发。此法适用于酵母菌﹑芽孢杆菌﹔不适用于固氮菌﹑乳酸杆菌﹑明串珠菌﹑法门氏菌和毛霉目中的大多数属种。此法简便易行﹐但必须注意防火和污染。

　　6、沙土管法

　　将沙或土过筛﹑烘干﹑装管﹑灭菌﹑然后将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀﹐放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分﹐干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态﹐可保存较长时期。此法适用于芽孢杆菌﹑梭状芽孢杆菌﹑放线菌﹑镰刀菌等。

　　7、麸皮法

　　将麸皮制成培养基﹐培养要保存的菌种﹐待生长良好后﹐置干燥器中保存。这是根据中国酿造酒﹑醋﹑酱时制曲的经验所采用的一种保藏方法﹐适用于谷物微生物区系中的种类。

　　8、L-干燥法

　　又称液体干燥法或真空干燥法﹐用含3%谷氨酸钠的0、1M磷酸缓冲溶液(pH7、0)做分散媒﹐将待保藏的微生物制成高浓度的细胞悬液﹐滴入无菌安瓿瓶中﹐每管0、05毫升﹔将安瓿瓶固定在多歧管上﹐并以水浴保持安瓿瓶内样品温度为10℃﹐在13、3~1、3帕的真空度下干燥﹐火焰封管保存。此法不经冻结﹐用真实泵迅速抽乾﹐可避免菌种的冻伤或死亡。广泛应用于病毒﹑噬菌体﹑细菌﹑酵母菌﹑蓝藻﹑原生动物等。