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稳定细胞系构建的原理步骤解析

浏览次数:2166发布日期:2017-10-17
   稳定细胞系构建的原理步骤解析
  本文主要解析了稳定细胞系构建的原理和稳定细胞系建立的流程,及瞬时转染和稳定细胞系构建的区别与。帮助我们选择合适的细胞转染的方法,瞬时转染或稳定转染细胞
  真核蛋白表达的方式有两种:瞬时转染和稳定转染(稳定细胞系构建)。根据自身真核蛋白表达的目的选择合适的转染方法非常重要。瞬时转染持续时间较短,质粒转染进入细胞,3-4天就会丢失。因此可以得到少量的蛋白。相对于此,稳定抵不住筛选是一个长期的过程,需要足够的耐心和细心。
  稳定细胞系构建原理
  真核蛋白表达稳定细胞系建立的原理是,将我们所要的目的基因真核到宿主细胞上,随着细胞的生长繁殖,目的基因可以稳定的表达,在通过抗生素的不断加压筛选,zui终得到构建稳定细胞系的过程。相对于瞬时转染,稳定转染技术持续周期长,细胞整合稳定,能够满足后期对蛋白的大量需求。
  稳定细胞系构建  实验流程
  1.细胞培养
  细胞培养是真核蛋白蛋白实验中的*步,原核利用大肠杆菌,真核蛋白表达是培养哺乳动物细胞,常用的真核蛋白表达细胞有CHO,HEK293细胞,稳定细胞系建立选择CHO细胞。
  细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快复,防止在解冻过程中,产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下:
  1)预先加热水浴锅,温度至37-40℃,并在离心管中准备好10ml培养基
  2)从液氮罐或冰箱中取出细胞,迅速放进预热的水浴锅中,镊子夹住冻存管晃动,使其受热均匀
  3)当冻存管内完全融化时,注意用酒精擦拭冻存管消毒,将液体倒入含有10ml培养基的离心管中
  4)离心5min,去除上清,得到沉淀
  5)用培养基悬浮沉淀,并接种到培养瓶常规培养
  细胞复苏后,生长一段时间,95%的细胞贴壁生长,细胞状态良好,说明细胞复苏成功。
  2.稳定细胞系构建(一)
  以Lipofectamine转染试剂为例进行先瞬时转染,不同转染试剂参考说明书
  1)将复苏后常规培养的细胞按照1-3x10^5接种到6孔板中,加入2-4ml的完全培养基,混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜
  2)无菌状态下配置如下溶液:a 用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒
  b 用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂(血清的存在会影响转染效率,因此要使用无血清培养基转染)
  3)将ab溶液混合并摇匀,室温下放置30min左右
  4)细胞培养至80%单层左右,用无血清培养基洗涤细胞2次,每孔加入1ml的无血清培养基,并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向轻摇混匀,二氧化碳培养箱中37℃培养24小时
  5)将转染液倒出,换为完全培养基继续培养
  3.稳定细胞系建立
  24-72h加入选择性抗生素进行稳定细胞株筛选,预实验确定抗生素的zui佳浓度,确定抗生素对所选细胞的zui低作用浓度。1)提前一天接种细胞与24孔板中,待第二天长成25%单层为宜,二氧化碳培养箱中37℃过夜培养。
  2)第二天将培养液换成含抗生素的培养基,抗生素浓度按梯度递增(0,50,100,200,400,800,1000ug/ml)。
  3)培养15天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准,一般为400-800ug/ml,筛选细胞时可适当提高浓度
  4)二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代,使用预实验得到的抗生素浓度的培养基培养。后挑选单克隆,有限稀释法挑取单克隆。有限稀释法:将细胞消化下来做连续的10倍稀释,每稀释一梯度都在9孔板中培养,生长一周左右再次挑取单克隆进行培养,如此反复3次。
  5)Western blot或ELISA检测蛋白的表达情况,挑取多个单克隆进行表达检测,筛选出表达量zui高的克隆传代保存。
  zui终筛选出稳定高表达目的基因的细胞株,相对于瞬时转染稳定细胞系构建在后续可以节约大量的时间和成本,是满足活性蛋白大量制备的方法。
  真核系统蛋白表达的操作较为繁琐,困难,有一定的操作难点,相对原核表达得到的蛋白更具天然活性,同酵母表达相似,可以实现蛋白的各种修饰,只是真核蛋白表达可以实现蛋白的复杂、修饰。在制药,活性因子生产方面有很大应用。
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